VI. MATERIAL Y METODOS.

1.- Material

El estudio fue llevado a cabo en el Servicio de Psiquiatría del Hospital Ramón y Cajal de Madrid, con el consentimiento de la comisión de Investigación y Ensayos Clínicos de dicho hospital con fecha 19 de junio de 1989 y con el consentimiento de la Comisión de Docencia en junio de 1989.

La recogida de casos se realiza entre junio de 1989 y enero de 1991.

Fueron incluidos en este estudio de investigación 22 sujetos entre 20 y 44 años de edad, diagnosticados de trastorno por angustia con o sin agorafobia de acuerdo a los criterios del Diagnostic and Statistical Manual, tercera versión revisada, (American Psychiatric Association.1987) (DSM-III-R), mediante una entrevista semiestructurada (SCID-II) (361) y 12 sujetos voluntarios sanos, entre 20 y 30 años, sin reunir criterios para ningún diagnóstico en el eje I y eje II del DSM-III-R.

2.- Métodos utilizados
2.1.- Obtención de la muestra

Los pacientes proceden de la Unidad de Psiquiatría del Hospital Ramón y Cajal de Madrid, la mayoría del Servi­cio de Urgencias de dicho hospital.

Todos los sujetos fueron informados sobre el estudio de investigación y dieron el consentimiento de su participación por escrito. Dos de los pacientes a los que se le propuso el estudio, no quisieron participar por tener miedo al pinchazo de la cánula intravenosa durante la prueba o a los efectos secundarios del fármaco.

Se brindaron como voluntarios sujetos cercanos a nuestro entorno: médicos residentes y estudiantes.

Se realizan un examen físico y analítico completo para detectar criterios de exclusión. Todos los pacientes permanecieron como mínimo sin medicación los 15 días ante­riores a la realización del test, aunque la mayoría nunca había recibido psicofármacos.

Fueron excluidos del estudio los pacientes con las siguientes patologías: diagnóstico de esquizofrenia o de personalidad paranoide, trastorno obsesivo compulsivo, trastornos afectivos bipolares, situación de depresión severa y condiciones médicas que contraindican un tratamien­to con clomipramina: embarazo, enfermedades hepáticas, renales o gastroduodenales, hipertrofia prostática, epilep­sia, glaucoma, discrasias sanguíneas e hipertiroidismo o uso de medicación tiroidea; electrocardiograma o hallazgos de laboratorio sustancialmente anormales. También se excluyen los factores que alteran la secreción hormonal tales como obesidad y alcoholismo.

2.2.-Diagnóstico: Entrevista Diagnóstica Clínica semiestructurada.

Para evitar la variabilidad en la forma de reali­zación de la entrevista diagnóstica, lo que contribuiría a la falta de fiabilidad del diagnóstico, se utilizan formula­rios de entrevistas estructurados. Con este fin recientemen­te Spitzer y Williams (361) han desarrollado la entrevista clínica estructurada para el DSM-III-R (SCID-II), la cual se utiliza en este estudio.

Esta escala puntúa: 1 (Ausente o falso), 2 (Subum­bral) y 3 (Umbral o verdadero). Cuando un número predetermi­nado de items puntúa "3" se considera que el sujeto cumple suficientes criterios para ser diagnosticado según los criterios del DSM-III-R. Se descartan las patologías psi­quiátricas que suponen un criterio de exclusión también mediante este método.

Una vez realizado el diagnóstico, se estudian: las variables sociodemográficas y variables clínicas que a continuación se detallan y que incluyen: la presencia o ausencia de agorafobia de acuerdo a los criterios DSM-III-R, la presencia de síndrome premenstrual, el número de ataques durante el mes anterior, el tiempo de evolución, el antece­dente de haber sido visto por otros especialistas por el trastorno de pánico, la intensidad de estrés psicosocial y la evaluación global de sujeto durante el último año y en la actualidad, según los ejes IV y V del DSM-III-R; las hojas 4 y 5 de la Versión española del Sistema AMDP (362) que incluyen una exploración psicopatológica y somática,la escala heteroaplicada de Hamilton para la ansiedad (363), un inventario de situaciones y respuestas de ansiedad, el grado de limitación derivado de sus fobias incluido en la escala de fobias de Mark- Sheehan, el cuestionario de personalidad EPI y el cuestionario de adaptación para adultos de H.M.Bell.

2.3.- Variables sociodemográficas y clínicas

1. Edad en el momento del estudio
2. Sexo: Se distingue varón y mujer.
3. Estado civil. Se distingue: Soltero, casado, viudo, separado/divorciado y religioso.
4. Nivel de estudios: educación especial
enseñanza preescolar o primaria
BUP o bachiller superior
EGB o bachiller elemental
FP primer grado
FP segundo grado
licenciatura
Otros
sin estudios
5. Actividad laboral: no tiene /no procede
S/L
S/L mas actividad extra
profesión liberal
empresario autónomo
funcionario
funcionario directivo
empleado
directivo
obrero especialista
obrero cualificado (capataz)
obrero no cualificado (peón)
otra actividad
6. Situación laboral: estudiante
S.L.
en activo
sin empleo ni paro
subsidio de paro
incapacidad laboral parcial
incapacidad laboral total
gran invalidez
jubilado a su edad
jubilación prematura.
7. Nivel socioeconómico. Se distingue:
Alto (I)
Medio: alto, medio y bajo (II, III y IV)
Bajo (V)
8. Antecedentes personales médicos. Se registra la no presencia, la existencia de una enfermedad orgánica crónica, la existencia de una enfermedad orgánica agu­da, un traumatismo craneoencefálico, caídas o fractu­ras, convulsiones e intervenciones quirúrgicas.
9. Alergias. Se consideran presentes si existe historia de cualquier tipo de alergias.
10. Rasgos neuróticos infantiles. Considerado presente si existe alguno de estos síntomas: onicofagia, pesadillas nocturnas, enuresis nocturnas y tics motores.
11. Separación temprana de los padres.
Considerada presente cuando el niño es físicamente separado de uno o ambos padres permanentemente o duran­te varios meses antes de la edad de 10 años.
12. Antecedentes familiares psiquiátricos.
13. Consumo de alcohol. Se refleja: no consumo, consumo moderado, y excesivo (>100 mgr./día habitualmente o consumo muy excesivo con estado de embriaguez esporádi­co).
14. Consumo de tabaco. Se considera: no consumo, consumo menor de 10 cigarrillos/día y consumo mayor de esta cantidad.
15. Consumo de café. Se considera: no consumo, menos de 4 tazas de café y más de tres tazas de café.
16. Síndrome premenstrual
Existe desacuerdo en los síntomas que incluyen el sín­drome premenstrual y la intensidad que constituye un criterio diagnóstico. Aproximadamente el 90% de las mujeres refieren algún síntoma premenstrual a lo largo de sus vidas. La investigación en este campo es incom­pleta por la falta de escalas de medida homologadas.
De entre los síntomas descritos en el síndrome premenstrual tenemos: senos hinchados y sensibles, hinchazón abdominal, constipación, edema periférico y ganancia de peso, sudoración, erupción acneiforme, temblor, torpeza, apetencia por los carbohidratos y la sal, dolor de cabeza, letargia e insomnio e hipersom­nia, síntomas psicológicos de tristeza, ansiedad, irritabilidad, y humor lábil, cambios conductuales y cognitivos incluyendo disminución de la motivación, paranoia, sensibilidad al rechazo, e ideación suicida.
Nos parece interesante estudiar la presencia de síndrome premenstrual en estas pacientes y para ello hemos considerado como diagnóstico positivo la apari­ción durante los días previos a la menstruación y con una frecuencia superior al 90% de los ciclos menstrua­les de al menos tres síntomas de los siguientes, en intensidad suficiente como para interferir con la vida normal del sujeto, o la presencia de alguno de los síntomas en grado invalidante.
. Dolor de cabeza
. Apetencia por los carbohidratos y la sal
. Letargia
. Insomnio e hipersomnia
. Tristeza
. Ansiedad
. Irritabilidad
. Humor lábil
. Disminución de la motivación
. Hipersensibilidad al rechazo
. Paranoia
. Ideación suicida.
17. Presencia de agorafobia, según los criterios DSM-III-R, descritos en la introducción.
18. Número de ataques de pánico durante el mes anterior, también según los criterios DSM-III-R.
19. Eje IV del DSM-III-R (4). Proporciona una escala, la escala de intensidad de estrés psicosocial, para codi­ficar la intensidad global de un estímulo o conjunto de estímulos que provoquen estrés psicosocial, que se hayan presentado en el año anterior a la evaluación actual. Nos interesa por la posibilidad de que haya contribuido al desencadenamiento del trastorno mental y de que haya contribuido en la recurrencia.
Se registra el estrés psicosocial específico, especificando además si se trata de un predominio de acontecimientos agudos, de duración menor a seis meses, o un predominio de circunstancias crónicas, de duración superior a seis meses.
Se tiene en cuenta los siguientes tipos de es­trés: conyugal, paternidad, otras relaciones interper­sonales, laboral, situaciones ambientales, económico, legal, desarrollo, lesión o enfermedad somática, facto­res familiares y otros.
20. Eje V del DSM-III-R (4). Se trata de una escala de evaluación global del sujeto o escala GAF. Nos permite considerar la actividad psicológica, social y laboral a lo largo de un hipotético continuum que va de la salud a la enfermedad. No se incluyen las incapacidades debi­das a limitaciones físicas o ambientales.
Las puntuaciones se refieren a dos períodos:
- Actual. Nivel de actividad en el momento de la evaluación
- El último año. Nivel de actividad mejor durante varios meses en el transcurso del último año.
Se utilizan códigos desde 90 a 1, de mayor a menor actividad. La puntuación máxima o 90 se corresponde con la ausencia de síntomas o síntomas mínimos con buen funcionamiento en todas las áreas, interesado e impli­cado en una amplia variedad de actividades, efectivo socialmente, generalmente satisfecho con su vida, no tiene más que los problemas o preocupaciones propias de la vida cotidiana. La puntuación mínima se corresponde con un peligro persistente de lesiones graves a sí mismo o a los demás, incapacidad persistente para man­tener una higiene personal mínima, o intento de suici­dio grave con claro riesgo de muerte.
21. Evolución de la enfermedad: se evalúa el tiempo de evolución: menos de tres meses, entre tres meses y 1 año y, por último, más de un año; se evalúan también la existencia de antecedentes de haber sido tratado por otros especialistas a causa de este problema.
22. Antecedente de haber sido visto por otros especialistas por el trastorno de angustia. Se recoge sí o no.

2.4. Exploración psicopatológica y somática. Siste­ma AMDP.

Se utiliza la versión española del Sistema AMDP (Asociación para Metodología y Documentación en Psiquiatría) (López-Ibor JJ., 362). Se han utilizado las páginas 4 y 5: Exploración psicopatológica y exploración somática.

Se trata de un método muy útil para la estandari­zación de la exploración psicopatológica. Se aplicó cuanti­tativamente, de modo que cada item se puntuó 0 (Ausente) y 1 (Presente). La fiabilidad es más alta que si se valoran grados de intensidad de 1 a 3.

2.5. Escala heteroaplicada de Hamilton para la ansiedad (363)

Hamilton construyó esta escala para evaluar la neurosis de ansiedad como síndrome, no para medir la ansie­dad en sí misma o en pacientes con otros trastornos.

La escala permite un juicio cuantitativo sobre la intensidad de la ansiedad del paciente.

La escala se compone de 14 items, cada uno corres­ponde a un conjunto de manifestaciones. Para cada item se atribuye una puntuación entre 0 y 4. La puntuación 0 corres­ponde a la ausencia de manifestaciones, 1 a manifestaciones de intensidad ligera, 2 a manifestaciones de intensidad media, 3 a manifestaciones de fuerte intensidad y 4 a mani­festaciones de extrema intensidad, verdaderamente invalidan­tes. Según recomendaciones del autor, para la valoración de cada item se debe realizar una apreciación de todas las manifestaciones que lo componen, no de una sola; además la estimación debe combinar la frecuencia e intensidad.


Las variables que componen la escala son: conducta del paciente durante la entrevista, ánimo ansioso, tensión, miedos, insomnio, cambios o alteraciones cognitivas, depre­sión, síntomas somáticos de tipo general, cardiovasculares, respiratorios, gastrointestinales, genitourinarios y del sistema autonómico (dolores de cabeza y sudor injustifica­do).

La escala permite calcular una puntuación total y una puntuación para la ansiedad psíquica (suma de los punta­jes de los items 1,2,3,4,5,6, y 14) y una ansiedad somática (suma de puntajes de los items 7,8,9,10,11,12,y 13). Nos ha interesado la puntuación total, dado que con el siguiente inventario ya realizamos una evaluación precisa de la ansie­dad.

No existen valores estadísticos sobre puntuaciones medias en una población de pacientes neuróticos.

2.6. Inventario de situaciones y respuestas de ansie­dad.(364)

El principal objetivo de este test es crear un instrumento que evalúe por separado la frecuencia de res­puestas cognitivas, fisiológicas y motoras de ansiedad ante situaciones de la vida cotidiana, susceptibles de generarla.

Está formado por tres subescalas que evalúan la ansiedad de tipo cognitivo, fisiológico y motor.

Las respuestas del sistema cognitivo se refieren a pensamientos y sentimientos de preocupación, miedo e insegu­ridad; una serie de rumiaciones que llevan al individuo a un estado de alerta,desasosiego o tensión. Esto daría lugar a la falta de concentración, indecisión y la idea de que las personas de su entorno observan su conducta y se dan cuenta de sus problemas y torpezas.

En el inventario fisiológico, las respuestas son índices de activación del Sistema Nervioso Autónomo, como son: palpitaciones, taquicardia, sequedad de boca, dificul­tad para tragar, escalofríos, tiritones, temblor, sudora­ción, tensión muscular, respiración agitada y apnea, junto con la evaluación de otros síntomas: molestias en el estóma­go, náuseas, mareo y dolor de cabeza.

La subescala de ansiedad motora es un índice de agitación motora, fácilmente observables por otra persona. Se incluyen: dificultades de expresión verbal, como bloqueo o tartamudez, movimientos torpes, respuestas de huida o evitación, fumar, comer y/o beber en exceso, rascarse, hiperactividad y movimientos repetitivos con las manos y los pies.

Es un inventario con formato S-R, que incluye tanto situaciones como respuestas. Consiste en evaluar la frecuencia con que el paciente manifiesta una serie de respuestas o conductas de ansiedad ante distintas situacio­nes. Se utiliza una escala de cinco puntos para evaluar la frecuencia, con las siguientes categorías:
0= Casi nunca
1= Pocas veces
2= Unas veces sí, otras veces no.
3= Muchas veces
4= Casi siempre

El inventario consta de 22 situaciones.

Se corrige sumando las puntuaciones de cada ítem de cada subescala. Las puntuaciones directas obtenidas se convierten en centiles utilizando las tablas de baremos facilitadas por el autor. Se utiliza el baremo del grupo de población general para conocer la posición del sujeto con respecto a la misma.

2.7.- Escala para la fobia (Marks-Sheehan)
Consta de una serie de situaciones cotidianas en las que se incluye una escala de miedo con una puntuación de 0-10 para indicar cuanto miedo/ansiedad siente en las situa­ciones específicas, correspondiendo el 0 a nada en absoluto, de 1 a 3 ligero, de 4 a 6 moderado, de 7 a 9 marcado, 10 muy grave; en el apartado evitación se indica con qué frecuencia se evita la situación en concreto, siendo 0= Nunca, 1= A veces, 2= A menudo, 3= Muy a menudo, 4= Siempre.

1. Se comienza con la pregunta abierta de Fobias principa­les que quiere que sean tratadas con la posibilidad de relatar 4 fobias, con sus correspondientes escalas de miedo y evitación. Posteriormente:
2. El alejarse sólo de casa
3. ¿Cuánto teme a un ataque de angustia inesperado?. En caso afirmativo ¿cuánto evita hacer cosas debido a ese miedo?.
4. Viajar en autobuses, metro, trenes o coches.
5. Sitios concurridos, p.ej. tiendas, acontecimientos deportivos, teatros.
6. Amplios espacios abiertos.
7. Sentirme atrapado o encerrado en sitios cerrados.
8. Sentirme abandonado.
9. A herirme o a enfermar.
10. El escuchar o leer sobre temas médicos o enfermedades.
11. El comer, beber o escribir delante de otras personas.
12. Sentirse observado o centro de atención.
13. Estar con otras personas a causa de la timidez.
14. Otras situaciones específicas no indicadas aquí que le dan miedo.
15. Indique la distancia máxima a la que puede ir solo (Marque si es "m" o "Km"). 1=m, 2=Kt.



Por último la autovaloración global del grado de molestia o limitación derivado de sus fobias, con la pregun­ta ¿Podría evaluar el estado actual de sus fobias de forma global en la escala indicada a continuación? :
0. No hay fobias
1-3. Ligera molestia o limitación
4-6. Moderada molestia o limitación
7-9. Marcada molestia o limitación
10. Extremadamente incapacitante.

2.8.- EPI, Cuestionario de personalidad (365)

Se aplican las dos formas A y B. Este cuestionario describe las dimensiones fundamentales de la personalidad: neuroticismo y extroversión y añade una escala de sinceri­dad. Se interpreta de la forma siguiente:
Neuroticismo: Una puntuación alta indica labilidad emocio­nal e hiperactividad; son sujetos que tienden a ser hipersensibles, que se quejan de desa­rreglos difusos y manifiestan preocupación, ansiedad y depresión. Una puntuación baja señala una mayor estabilidad emocional.
Extraversión: Una puntuación alta indica una mayor extra­versión social del sujeto; son personas que tienden a ser expansivos, impulsivos y no inhibidos, que les gustan los contactos so­ciales y las actividades de grupo. Una pun­tuación baja señala una mayor introversión, propia de personas tranquilas, retraídas e introspectivas, a quienes les gustan más los libros que las personas, la vida ordenada y la seriedad aún en cosas cotidianas.
Sinceridad: Una puntuación alta indica mayor autenticidad en el sujeto al contestar al Cuestionario. Una puntuación baja no señala una persona mentirosa o poco sincera, pero puede invali­dar la aplicación de la prueba.


2.9. Cuestionario de adaptación para adultos. H.M.Bell.
Adaptación española por E. Cerdá.(366)

El cuestionario mide cinco sectores distintos: familiar,salud, social, emocional y profesional, y nos permite obtener información válida acerca de lo que piensa y siente el sujeto sobre sus relaciones familiares, sobre el funcionamiento de su organismo, acerca de sus amistades o relaciones extrafamiliares, sobre cómo el individuo compren­de y vive sus sentimientos y emociones y hasta qué punto es dueño o esclavo de su propia vida emocional y el grado de satisfacción que obtiene el individuo de su trabajo y de las circunstancias ambientales en que éste se realiza.

La sección "Adaptación profesional" sólo fue valorada, según instrucciones del autor, en aquellas perso­nas que estaban trabajando por cuenta ajena e insertas en un grupo laboral durante el período de tiempo en el cual se administró el cuestionario. Las puntuaciones obtenidas fueron interpretadas en 5 grados: "excelente", "buena", "normal", "no satisfactoria" y "mala",siguiendo la tabla de corrección indicada por el autor.


2.10.- Test de estimulación con clomipramina

Nos permite valorar indirectamente la función serotonérgica central de estos pacientes al comparar la respuesta hormonal secundaria a 12,5 mg de clomipramina intravenosa con la obtenida en controles.

2.10.1.Procedimiento a seguir

Se realiza en la Unidad Metabólica del Servicio de Endocrinología del Hospital Ramón y Cajal de Madrid.


A la 8:30 a.m., con el paciente en ayunas de 12 horas en cuanto a alimentos y tabaco, se coge una vía venosa periférica con suero salino fisiológico; se realiza en este momento la primera extracción (-30'). A la media hora se realiza de nuevo otra extracción basal (0'). En ambas se extraen 10 cc de muestra. Para eliminar la influencia del estrés provocado por la punción se considera basal la segun­da muestra (0 min).

Trás la 2ª extracción basal, se administra una infusión de 12,5 mg. de Clomipramina diluidos en 100 ml. de suero salino durante 10 minutos. Posteriormente se realizan nuevas extracciones sanguíneas a los 30, 60, 90 y 120 minu­tos después de haber terminado la infusión (15 cc. cada una).

Se realizan mediciones en todos los tiempos de: Prolactina (Prl), cortisol (Cor) y hormona de crecimiento (GH) y en los cuatro últimos tiempos se hacen también determinaciones de los niveles plasmáticos de Clomipramina y demetilclomipramina.

Durante toda la duración de este test el paciente se encuentra despierto y en posición de reposo en decúbito supino, dado que es posible una alteración hormonal por el sueño y el ejercicio.

Las muestras se centrifugan inmediatamente después de la colección y los sueros se conservan a -20º C hasta el análisis, que describimos a continuación. Ninguna muestra necesitó eliminarse por haberse hemolizado.

Se realiza en la mitad de los pacientes y en tres de los controles la misma prueba con placebo, días previos a la realización del test de clomipramina.


En toda administración de un fármaco hay factores incidentales y factores característicos (367). El propósito del control con placebo en esta prueba es encontrar si la respuesta hormonal al fármaco es debido a las característi­cas farmacológicas o a factores incidentales tales como expectación generada en el paciente por su creencia sobre el fármaco administrado.

La metodología sólo difiere de la anterior en que en vez de infundir un suero salino de 100 -ml con 12,5 mgrs de CMI, se infunde el suero salino limpio sin medicación; obviamente no se realizan determinaciones de fármaco.

2.10.2.Determinación de hormonas.

A) Prolactina

Se determina mediante radioinmunoensayo; se aplica la técnica conocida como "Doble anticuerpo". Este método precisa los siguientes reactivos:
1) Prolactina humana en viales estándar, que contienen una concentración conocida de prolactina calibrada a: 0; 2,3; 4,6; 9,3; 18,7; 37; 75 Y 150 ng/ml.
2) Anticuerpos anti-Prl (ATOM-R), que se obtienen inyec­tando prolactina humana en nódulos linfáticos de cone­jo.
3) Suero normal de conejo (DIAGNOSTIC BIOCHEM CANADA-R).
4) Prolactina humana marcada con I-125 (SORIN ESPAÑA-R).
5) Gammaglobulina antisuero de conejo (CALBIOCHEM-R).
6) Suero humano liofilizado que se utiliza como control. En este tubo sólo se deposita la h-Prl marcada con I-125, lo que permite conocer el valor de la radioacti­viidad total y controlar si el trazador se conserva en buen estado.

Inicialmente se preparan los tubos de suero previamente centrifugados y conservados a -20 º C, y se aspiran 25 ul de la muestra del paciente, 100 ul de cada uno de los viales estándar y 100 ul del vial control (llamado de cuentas totales "CT").

A continuación se añaden 100 ul del primer anti­cuerpo (anti-hPrl) a todos los tubos, excepto al tubo de CT y al llamado "tubo blanco o inespecífico". Este último tubo sólo va a contener el suero de conejo, el trazador y el antisuero de conejo, lo que permite controlar la calidad de la precipitación obtenida con estos reactivos.

Posteriormente se introducen 100 ul de suero normal de conejo en todos los tubos, excepto en el CT, y se dejan incubar durante 24 horas aproximadamente.

Al día siguiente se ponen 100 ul de trazador (h-Prl marcada con I-125) en todos los tubos.

Pasadas 48 horas se añade el segundo anticuerpo (Ig antisuero de conejo) en todos los tubos a excepción del control. Se dejan incubar durante 24 horas para permitir que se produzca la precipitación de los complejos antígeno-anticuerpo.

Al día siguiente se centrifugan durante una hora, se aspira cuidadosamente el contenido de todos los tubos, y se lleva al contador de radioactividad.

Conocida la radioactividad media de cada tubo, se procede a calcular la relación B/REF %, de acuerdo con la siguiente fórmula:

B Actividad media estándar o de la muestra
---- % = ----------------------------------------- X 100
REF Actividad media del tubo cero estándar

De esta forma, se obtienen diversos valores de radioactividad total (tubo de control): La del tubo cero estándar con una relación B/REF % del 100% , la de los restantes tubos estándar con una relación B/REF % menor del 100% y proporcional a la concentración de Prl en cada uno de ellos y la de la muestra investigada. LLevando los valores porcentuales a un eje de coordenadas y las concentraciones conocidas de Prl (expresadas en ng/ml) a un eje de abscisas, se puede obtener una gráfica con una curva estándar. Una vez conocida la concentración de Prl para cada valor porcentual en cada punto de la curva, una simple interpolación permite calcular la concentración de Prl correspondiente al valor porcentual (B/REF %) de cada muestra investigada.

En el laboratorio de referencia se consideran normales hasta 20 ng/ml de Prl en el hombre y hasta 25 ng/ml en la mujer.

B) Cortisol

Se determina por radioinmunoensayo. El método empleado (CorTCTK-125 de SORIN BIOMEDICA) se basa en la competencia entre cortisol marcado con I-125 y cortisol sérico por un número fijo y limitado de anticuerpos anticor­tisol. La cantidad de cortisol radioactivo unido a los anticuerpos será inversamente proporcional a la concentra­ción de cortisol libre presente en cada muestra. Para la determinación se utilizan unos tubos especiales en cuya pared se han fijado los anticuerpos por el método CATT. El kit de trabajo se conserva satisfactoriamente a una tempera­tura entre 2 y 8ºC. Nunca deben mezclarse reactivos proce­dentes de lotes diferentes. Cada kit viene provisto de los siguientes reactivos:

- Cortisol marcado con I-125. Cada vial contiene: La hormona marcada, proteínas, conservantes y un colorante inerte, rojo, en un tampón de fosfato. La radioactivi­dad aproximada es de 1,5 uCi (55,5 kBq) por vial.

- Cortisol sérico en viales estándar (0-6). El vial cero contiene 1,5 ml de una solución de suero humano con cortisol libre. Los viales 1-6 albergan 1 ml de solu­ción sérica humana con una concentración de cortisol calibrada a 25, 50, 100, 200, 400 y 800 ng/ml (68,8; 137,5; 275; 550; 1100 y 2200 nmol/L) respectivamente.
- Tubos cuya superficie interna ha sido recubierta con antisuero de conejo (método Catt).
- Un vial con suero humano liofilizado que se utiliza de control.

Igual que se ha explicado con la Prl, todas las muestras pudieron ser analizadas. Tras su centrifugación, el suero se conservó a -20ºC. Por último, para conseguir una medida precisa de nivel plasmático elevado (mayor de 800 ng/ml), la muestra se diluyó con el vial cero estándar. Todas las determinaciones se realizan por duplicado.

El esquema operativo es el siguiente: En primer lugar, se preparan los tubos cogiendo 100 ul, tanto de los viales estándar cómo del vial de control y de la muestra, se añade a continuación 500 ul de trazador a cada tubo.

A continuación, todos los tubos se agitan suave­mente con un vortex, durante 1-2 segundos.

Posteriormente, se incuban durante hora y media a 37ºC.

Pasado este tiempo, se aspira cuidadosamente el contenido de todos los tubos, hasta que no queda ningún resto de colorante rojo.

Finalmente, se mide la radioactividad de los tubos. Conocida la radioactividad media de cada tubo, se procede a calcular la relación B/Bcero %, dividiendo la actividad de la muestra o la de los tubos estándar (tubos 1-6) entre la radioactividad media del tubo cero estándar, según la siguiente fórmula:

B Actividad media estándar o de la muestra
----- % = ------------------------------------------ X 100
Bcero Actividad media del tubo cero estándar

Operando de la misma forma que en la determinación de la Prl, se obtiene una curva en la que a cada valor porcentual le corresponde una concentración conocida de cortisol. Una vez conocida la concentración de cortisol para cada valor porcentual en cada punto de la curva, una inter­polación permite calcular la concentración de cortisol correspondiente al valor porcentual (B/Bcero %) de cada muestra investigada.

Los valores normales en el laboratorio de referen­cia oscilan entre 9 y 25 ng/ml (1 ng/ml de cortisol = 1 nmol/l de cortisol dividido por 2,75). La sensibilidad es de 4,0 0,56 ng/ml.

C) Hormona de crecimiento

Se determina por RIA, mediante el método de "Doble anticuerpo". El procedimiento operativo es similar al des­crito para la determinación de Prl. Los reactivos, adaptados a la determinación de GH, son proporcionados por las mismas firmas comerciales.

En el laboratorio de referencia se consideran valores normales hasta 5 ng/ml de GH.

2.10.3.- Niveles de clomipramina

La medición de las concentraciones plasmáticas de clomipramina y desmetilclomipramina se lleva a cabo en el Servicio de Bioquímica del Hospital Ramón y Cajal. Es reali­zada por Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC). Se utilizan: Hexano, acetonitrilo y dietilamina de grado espe­cial para HPLC de E. Merck, Darmstadt, G.R.F. La fase móvil para HPLC es una mezcla de : Dietilamida (DEA), agua (H2O), acetonitrilo (AcN) y etanol (EtOH). 5/1, 5/8/990, v/v se filtra a través de membrana, con un tamaño de poro de 0,45 UM (micras), y posteriormente se filtra en un baño ultrasó­nico durante 15 minutos, estando ya lista para su uso.

Condiciones del HPLC: El aparato es un cromatógra­fo con líquido de alta presión, modelo SYSTEM GOLD, de la casa Beckman Co. y un detector ultravioleta modelo 167, con longitud de onda 254 nm (Beckman Co.). La columna usada es una ultraesfera de sílice (15 cm X 4,6 mm, tamaño de partí­cula 5 micras) de Beckman. Se dibujan los cromatogramas y se calcula el área de los picos de acuerdo a la integración del software del sistema Gold.

Como estandar interno, siempre se utiliza uno de los antidepresivos analizados, el cual no está incluido en el ensayo de los pacientes.

Procedimiento: Se utiliza como estandar interno: 0,2 ml de imipramina. Se evapora con nitrógeno. Se añade 1 ml de suero, 0,2 ml de sosa NaOH, 1,0 M, 5ML de N-HEX/ISO­PROP (98/2 v/V). Se rota durante 15 minutos y se centrifuga durante 5 minutos a 5000 rpm.

La fase orgánica se separa de lo anterior y se evapora con N2 a 25ºC. El residuo que queda de la evapora­ción se disuelve en 100 microlitros de fase móvil e inyecta­mos 20 microlitros. Se inyecta en HPLC (nosotros construimos gráficas de calibración según los datos del suero control), conteniendo cantidades conocidas de cada droga para calcular la concentración de ejemplos desconocidos, previa calibra­ción con curvas de concentraciones conocidas.

2.10.4.- Estadística Descriptiva
El estudio estadístico se realiza mediante el programa informático SIGMA. Se aplican los siguientes proce­dimientos:

De las variables cuantitativas se calculan la media, desviación típica, error estándar, tamaño y valores mínimo y máximo.

De las variables cualitativas se estudian la frecuencia absoluta y porcentaje de cada una de las catego­rías que las componen.

2.10.5.- Estadística analítica
1) Comprobación de la bondad del ajuste de las distribuciones. Test de
Kolmogo­rov-Smirnov

En las variables cuantitativas se comprobó el ajuste a una distribución normal de los valores cuantitati­vos mediante el test de Kolmogorov-Smirnov.

2) Comparación de medias en muestras inde­pendientes y en muestras pareadas.
Se realiza comparación entre las medias de los valores hormonales en los trastorno de pánico y control en cada tiempo después de la infusión de CMI y también se realizan comparaciones en el tiempo basal entre ambos grupos diagnósticos.

Para ver la influencia del tratamiento (Clomipra­mina/placebo) y del tiempo se realiza comparación de medias en muestras pareadas.

Se comparan los valores hormonales basales con los valores hormonales postinfusión de clomipramina en cada diagnóstico.

3) Análisis de la varianza (ANOVA)
Para ver la influencia del sexo y del diagnóstico en los valores hormonales basales y en el incremento máximo de cada hormona, y por tratarse de variables cualitativas, se realiza análisis de la varianza de dos factores. Se realiza en el grupo de sujetos tratados con CMI, para no alterar la necesaria condición de independencia de las variables en esta prueba.

Se realiza análisis de la varianza de medidas pareadas en el caso de estudiar la influencia del factor tiempo y del factor tratamiento.

4) Regresión lineal
Para ver la influencia de la edad en los valores hormonales basales y en el incremento máximo de cada hormona después de la infusión de clomipramina. Se realiza en pa­cientes del mismo sexo en el caso de que su influencia fuese encontrada significativa.

5) Correlación entre variables cuantitativas
Analiza la presencia de una relación lineal entre dos variables numéricas. Se utiliza para correlacionar todos los niveles hormonales y concentraciones del fármaco, me­diante la correlación entre variables continuas; se utilizan los coeficientes de correlación de Pearson. Este análisis permite conocer si dos variables están correlacionadas entre sí, es decir, si variaciones de una coinciden con variacio­nes de la otra.

De esta correlación no se pueden extraer conclu­siones de causalidad. Puede ocurrir que dos variables estén correlacionadas debido a que una de ellas sea responsable de parte del valor de la otra directa o indirectamente, o porque exista un factor común a ambas.


Se correlacionan los niveles hormonales basales entre sí; se correlacionan los niveles de clomipramina en el tiempo de máxima concentración, el cual suele coincidir con el tiempo +30, con los niveles hormonales, tanto basales como postinfusión de CMI y con el incremento hormonal máximo de cada hormona. Por último se correlacionan todos los niveles hormonales basales con los niveles hormonales pos­tinfusión y con los incrementos máximos de cada hormona. Se correlacionan también los incrementos máximos hormonales.

La correlación se realiza en los diferentes diag­nósticos y dentro de éstos en cada sexo diferente.